目的建立康腹止泻片微生物限度检查法。方法采用培养基稀释法。结果该法能有效消除康腹止泻片在检验条件下对细菌、真菌及酵母菌的抑制作用;控制菌可用常规法检查。结论该法简单、快捷,可用于康腹止泻片的微生物限度检查,有效控制其质量。

康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水士不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用,若用常规法对其进行微生物限度检查,结果将不能真实反映样品的污染情况。为此，根据《中国药典》2010年版的有关规定, 对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证,以确定其是否适用于本品的微生物限度检查,从而准确有效地检出样品中污染的微生物。验证表明,采用培养基稀释法对本品进行检查,可使污染的微生物能被顺利检出,常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行,能有效控制康腹止泻片的质量,并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。

1仪器（那艾仪器-微生物限度检查仪NAI-XDY-3M）与试药

1.1菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)10123] ,均购自中国药品生物制品检定所;黑曲霉(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。

1.2培养基

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。

1.3供试品

康腹止湖(批号41EA1) ,大幸药品株式会社。

2方法与结果.

2.1菌液的制备[4]

2.1.1大肠埃希菌、黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中,培养18 ~ 24 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50~ 100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制成每1 mL含菌数为< 100 cfu的菌悬液。

2.1.2色念珠菌取新鲜培养物接种至改良马J培养基中,培养24 ~ 48 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50 ~ 100 cfu的菌悬液。

2.1.3黑曲霉取新鲜培养物接种至改良马J琼脂斜面培养基中,培养5~7 d ,加入0.9%无菌氯化钠溶液3~5 mL ,将孢子洗脱。然后,用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内,用0.05%(体积分数)聚山梨醇的0.9%(体积分数)无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数50~ 100 cfu的孢子悬液。

2.1.4金黄葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌一为革兰氏阳性球菌, 呈葡萄状排列,无芽孢,无荚膜,能分解甘露醇,血浆凝固酶阳性。该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种,能引起人体局部化脓性病灶,严重时可导致败血症。

3、血琼脂培养基:

成分:营养琼脂100ml

脱纤维羊血(或免血) 10ml

制法:将营养琼脂加热融化,待冷至50°C左右无菌操作加入脱纤维羊血(或兔血)摇匀,制成平板，置冰箱内备用。

4、菌落特征:

血琼脂平板:菌落呈金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。Baird-Parker平板:菌落呈圆形,光滑,凸起,湿润,直径为2一-3mm ,颜色呈灰色到色,边缘为淡色,周围一-混浊带,在其外层有一透明带。

5、镜检:为兰氏阳性菌,排列呈葡萄状,无芽孢,无荚膜,致病性葡萄球菌,菌体较小,直径约为0.5um- -1um。

2.2供试液的制备

取样品10g ,加入pH7.0氯化钠0蛋白胨缓冲波至100 mL ,胸浆仪打碎,摇匀,制成1 : 10的供试液。

2.3验证试验

验证实验所用培养基均按《中国药典》2010年版附录"微生物限度检查法要求,进行培养基适用性检查,且均符合规定。

2.3.1细菌、真菌及酵母菌计数(平皿法培养基稀释法)在确定适合的检查方法后,验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

试验组:各取1 : 10供试液

本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分,有一定的抑菌作用 ,验证试验结果证明,本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等,或几法联用。于本品是中成药,推断其抑菌作用不会太强,因此尝试采用培养基稀释法,通过扩大培养基的使用量,使供试品在培养基中稀释,结果各规定菌株的回收率均达到药典要求;控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单, 不需要特殊仪器设备,只需增加培养基量,即可很好地消除本制剂在试验条件下的抑菌作用问题,因此本方法简便快捷、准确有效,能很好地控制康腹止泻片的质量。